膜片钳专业知识

1.膜片钳技术的应用学科

膜片钳技术发展至今,已经成为现代细胞电生理的常规方法,它不仅可以作为基础生物医学研究的工具,而且直接或间接为临床医学研究服务,目前膜片钳技术广泛应用于神经(脑)科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。

随着全自动膜片钳技术(Automatic patch clamp technology)的出现,膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性,在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。 (1)膜片钳技术在通道研究中的重要作用应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率,还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。

同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术,膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。

利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道,膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流,可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程,包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力,离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。

使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响,来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响,拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点,可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点,即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点,离子通道抑或是其它的变构位点上。

(2)与药物作用有关的心肌离子通道心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。近年来,国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展,使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。

(3)对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究,了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明,缺血性脑损害过程中,Ca2+ 介导现象起非常重要的作用,缺血缺氧使Ca2+通道开放,过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载,导致神经元及细胞膜损害,膜转运功能障碍,严重的可使神经元坏死(4)对单细胞形态与功能关系的研究将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合,在全细胞膜片钳记录下,将单细胞内容物或整个细胞(包括细胞膜)吸入电极中,将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA,再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测,借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本,为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。

目前国际上掌握此技术的实验室较少,我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。(5)对药物作用机制的研究在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物,研究它们对通道功能的可能影响,了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。

这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域,既有对西药药物机制的探讨,也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放,从而减少钙内流,对缺血细胞可能有保护作用。

陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。(6)在心血管药理研究中的应用随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。

正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。(7)创新药物研究与高通量筛选目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。

最近几年,分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合,产生了自动化膜片钳等一些新技术。

(8)在神经科学中的应用膜片钳技术与离体脑片技术结合,可以定位研究神经元离子通道,还可以进行神经元突触联系的研究,与使用培养的或急性分散的神经元相比具有不可替代的优势。

2.膜片钳技术原理有那些

膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来,由于电极尖端与细胞膜的高阻封接,在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就代表单一离子通道电流。

膜片钳技术的建立,对生物学科学特别是神经科学是一具有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个)的离子通道分子活动的技术。

此技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起,改变了既往各个分野互不联系、互不渗透,阻碍人们全面认识能力的弊端。

3.全自动膜片钳技术有什么作用

膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。

是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术()发展到全自动膜片钳技术()。

传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞(或一对细胞),对实验人员来说是一项耗时耗力的工作,它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选,也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题,它不仅通量高,一次能记录几个甚至几十个细胞,而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化,免除了这些操作的复杂与困难。

这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了!签于全自动膜片钳技术的这些优点,目前已经广泛的用于药物筛选。

4.

手摇式接地电阻测试仪(好像叫Z80吧)已经淘汰了,它的测试准确度受使用者影响,快了慢了测的都不准确,而且测试电压较高,对被测物有影响。

钳式表应用范围非常有限,测量的值是包括被测接地电阻在内的整个回路的接地电阻。没有构成回路的接地无法测量。

另外,接地线一般都有泄露电流,钳表的适用范围为1mA到30A,泄露电流太大会导致测量不准确。 现在应用最广泛的是4102型接地电阻表,分指针型和数字型,价钱不高,经济实惠。

资金充裕的话可以购买更高级的好像是奥地利产的,带自动变频,测量更准确。

5.电压钳原理及操作

其设计原理是根据离子作跨膜移动时形成了跨膜离子电流(I),而通透性即离子通过膜的难易程度,其膜电阻(R)的倒数,也就是膜电导(G)。因此,膜对某种离子通透性增大时,实际上时膜电阻变小,即膜对该离子的电导加大。根据欧姆定律V=IR,即I=V/R=VG,所以,只要固定膜两侧电位差(V)时,测出的跨膜电流(I)的变化,就可作为膜电导变化的度量,即可了解膜通透性的改变情况。

电压钳装置有两个微电极插入细胞,一个是测量膜电位的微电极Em,它通过高阻抗前级放大器(XI)检测膜电位(Em),并将信号输入反馈放大器(FBA);另一电极I’与FBA输出端相连,用作向细胞内注入电流,FBA的两个输入端中一个接受电位Em的输入,另一个接受指令电位(C),当两者电位相等时输出电流为零,当两者出现差异时,FBA经电极I’输出向细胞内注入电流,该电流在膜两侧产生趋向于指令电位C的电位变化,如此构成一个使膜电位始终等于指令电位C的反馈电路,此时记录的Im就可反映膜电导G的变化。其实Im就是经电极I’注入的电流,后者在电压钳制期间精确地对抗通道电流而使膜电流保持恒定。

分别用Na+通道阻断剂河豚毒素(TTX), K+通道阻断剂四乙胺(TEA)作用于细胞膜。

与对照组相比较,TTX处理时阻断Na+通道,仅剩的K+通道,在零电位以上;

TEA处理时阻断K+通道,仅剩的Na+通道,在零点位以下。

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